關(guān)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告三篇

　　篇一：劉希偉201100140041分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

　　質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測(cè)

　　姓名：XXX學(xué)號(hào)：2011001400XX年級(jí)：20XX級(jí)生物基地班 實(shí)驗(yàn)日期：2013年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。

　　3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實(shí)驗(yàn)原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類(lèi)群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類(lèi)型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但是兩者變性與復(fù)性所依賴(lài)的溶pH值不同。在pH值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類(lèi)似，乙醇沉淀

　　DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀(guān)察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話(huà)，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。

　　分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的.分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬(wàn)bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進(jìn)一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個(gè)因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場(chǎng)、緩沖液和溫度。

　　三、【實(shí)驗(yàn)材料】

　　1、實(shí)驗(yàn)儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號(hào)槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號(hào)筆、手套等。

　　2、實(shí)驗(yàn)試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無(wú)水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個(gè) ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　　（100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長(zhǎng)。 過(guò)夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過(guò)夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，生長(zhǎng)速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　�。�1）稱(chēng)量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱(chēng)重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　　（3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)。Tris—Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。

　�。�4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對(duì)應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　　（5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)��?yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時(shí)變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無(wú)水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)�的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　　（7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　�。�8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o(wú)色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。

　�。�9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)。同時(shí)含有EDTA是二價(jià)陽(yáng)離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　　（2）將上述的溶液平均分配到2個(gè)1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無(wú)色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會(huì)影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會(huì)損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類(lèi)，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時(shí)溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　　（4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　　（5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無(wú)水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　　（6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測(cè)

　　（1）稱(chēng)取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補(bǔ)充在溶膠過(guò)程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　　（2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過(guò)膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀(guān)察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。

　�。�4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。

　�。�5）凝膠成像儀觀(guān)察。

　　五、【注意事項(xiàng)】

　　（1）滴加溶液II時(shí)，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動(dòng)作要快，因?yàn)閺?qiáng)堿在溶液中停留時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)破壞質(zhì)粒DNA。

　�。�2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強(qiáng)堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。

　　篇二：山東大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

　　一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>

　　1，了解小鼠膜的剪取方法，以及小鼠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

　　2，掌握并了解蘇丹三染色的原理及方法。

　　3，理解蘇丹Ⅲ脂類(lèi)染色的基本原理。

　　二，實(shí)驗(yàn)原理：

　　脂類(lèi)細(xì)胞化學(xué)的主要目的是研究細(xì)胞中脂類(lèi)物質(zhì)的成分變化以及分布。

　　在動(dòng)物細(xì)胞中，脂肪是動(dòng)物體主要的儲(chǔ)能物質(zhì)，很多種細(xì)胞都含有脂肪。

　　通常，細(xì)胞中的脂肪和類(lèi)脂體混合物以游離的液滴狀態(tài)懸浮在細(xì)胞質(zhì)中，比

　　如肝細(xì)胞。在脂肪含量很高的`脂肪細(xì)胞中，游離的脂肪液滴可以聚集在一起，

　　占據(jù)大部分細(xì)胞質(zhì)空間，將細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核擠到細(xì)胞邊緣。

　　脂類(lèi)染色最常用的染料是蘇丹系列染料，本實(shí)驗(yàn)即使用蘇丹Ⅲ為脂肪顯

　　色。蘇丹Ⅲ是一種橙紅色偶氮染料，由于其在脂肪中的溶解度高于在乙醇中

　　的溶解度，當(dāng)用70%乙醇溶解的蘇丹Ⅲ飽和溶液浸染脂肪細(xì)胞時(shí)，蘇丹Ⅲ會(huì)

　　從70%乙醇中脫離，溶解并集中在脂肪液滴中，使脂肪細(xì)胞著色（橘黃色）。

　　以70%乙醇作為蘇丹Ⅲ的溶劑可以減少乙醇對(duì)脂肪細(xì)胞中脂肪液滴的溶解，

　　染色較大的脂肪塊。染色的主要過(guò)程不涉及化學(xué)變化。

　　三，實(shí)驗(yàn)器材及材料

　　1，器材 ：鑷子兩把 顯微鏡 托盤(pán)一個(gè) 剪刀一把 滴管一支 載玻片（蓋

　　玻片）

　　2，試劑：蘇丹Ⅲ染液 蒸餾水 70%乙醇 生理鹽水 甲醛鈣溶液 四，實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、斷頭法處死小鼠，置于解剖盤(pán)中，剪開(kāi)腹腔，用鑷子提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，用剪刀連同蓋玻片和其上粘的腸系膜取下，反扣于已滴加甲醛鈣的載玻片上，固定 20min。

　　2、用吸管吸取蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗掉甲醛鈣溶液。

　　3、用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復(fù)步驟二的操作，沖洗。

　　4、滴加蘇丹Ⅲ于蓋玻片上，染色30min。

　　5、吸去載玻片上溢出的染液，擦凈載玻片表面及周邊，顯微鏡觀(guān)察。 五，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：

　　脂肪細(xì)胞呈圓球形，內(nèi)充滿(mǎn)橘黃色之類(lèi)物質(zhì)

　　由于腸系膜標(biāo)本過(guò)厚，細(xì)胞染色效果起初不太明顯，脂肪細(xì)胞漸漸變?yōu)殚冱S色，可觀(guān)察到清晰的脂肪細(xì)胞，但細(xì)胞分散程度較差，單細(xì)胞形態(tài)較為少見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)較難觀(guān)察的到。隨著染色時(shí)間增長(zhǎng)，基本可以分辨出脂肪滴與細(xì)胞質(zhì)。六，實(shí)驗(yàn)總結(jié)：

　　1，制作腸系膜玻片時(shí)要注意去除血管組織，盡量將其壓薄，便于后期染色，觀(guān)察。

　　2，染色必要時(shí)可采取反扣蓋玻片染色，以保證染色充分，均勻。 3，染色完后去除多余染液以便于觀(guān)察。

　　篇三：山東大學(xué)微生物生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

　　一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>

　　1。 證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說(shuō)明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。 2。掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解試驗(yàn)的原理和方法。 3。了解糖發(fā)酵的原理和在腸細(xì)菌堅(jiān)定中的重要作用。 4。掌握通過(guò)糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。

　　5。 了解吲哚和甲基紅試驗(yàn)的原理以及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。

　　二、【實(shí)驗(yàn)儀器與試劑】

　　菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌

　　培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗(yàn)）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖

　　發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵試驗(yàn)）；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；

　　試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、

　　儀器：酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管

　　三、【實(shí)驗(yàn)原理】

　　1。在所有生活細(xì)胞中存在的全部生物化學(xué)反應(yīng)稱(chēng)之為代謝，代謝過(guò)程主要是酶促反應(yīng)過(guò)程，由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來(lái)鑒別不同的細(xì)菌，尤其是在腸桿菌科細(xì)菌的鑒定中，生理生化試驗(yàn)占有重要的地位。

　　2。淀粉的水解：由于微生物對(duì)淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過(guò)加水裂解大的'物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精，雙糖和單糖；而淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周?chē)�的淀粉，在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)用碘處理其菌落周?chē)�不呈藍(lán)色，而是無(wú)色透明圈，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。

　　3。油脂的水解：在油脂培養(yǎng)基上接種細(xì)菌，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀(guān)察菌苔的顏色，若出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則說(shuō)明此中菌可產(chǎn)生分解油脂的酶。

　　4。 糖發(fā)酵試驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們?cè)诜纸馓穷?lèi)物質(zhì)的能力上有很大的差異。有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸，醋酸，丙酸等）和氣體（如氫氣，甲烷，二氧化碳等）;有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會(huì)使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會(huì)收集到一部分氣體。若細(xì)菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無(wú)氣體。 5。IMVC實(shí)驗(yàn)主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。

　�。�1）吲哚試驗(yàn)：是用來(lái)檢測(cè)吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白

　　胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對(duì)二甲基苯甲醛反應(yīng)生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實(shí)驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測(cè)

　　的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽(yáng)性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

　�。�2）甲基紅試驗(yàn)（MR）：某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進(jìn)而被分解產(chǎn)生甲酸，

　　乙酸和乳酸等多種有機(jī)酸，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，即甲基紅反應(yīng)。大腸桿菌為陽(yáng)性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

　　四、【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1。 淀粉水解實(shí)驗(yàn)

　　（1）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，在酒精

　　燈火焰旁倒平板，每組兩個(gè)平板。 （2）用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分。

　　（3）接種：在無(wú)菌操作臺(tái)上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不

　　同的部分點(diǎn)種，如圖一所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)基，在平板的反面對(duì)應(yīng)部分貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別寫(xiě)上菌名，以免混淆。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28℃溫箱中培養(yǎng)兩天。

　�。�5）觀(guān)察：取出培養(yǎng)基，觀(guān)察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開(kāi)平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，

　　輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿(mǎn)整個(gè)平板，觀(guān)察培養(yǎng)皿中菌落周?chē)�是否有無(wú)色透明圈，若有無(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉已經(jīng)被水解，為陽(yáng)性，反之則為陰性。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　圖一：淀粉水解試驗(yàn)接種示意圖圖二：油脂水解試驗(yàn)接種示意圖 2。油脂水解試驗(yàn)

　�。�1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，充分振蕩，

　　使油脂均勻分布，在酒精燈火焰下倒平板，每組兩個(gè)平板。 （2）用記號(hào)筆在在平板底部劃成四部分。

　　（3）接種：在無(wú)菌操作臺(tái)上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別劃十字線(xiàn)接種于平板相對(duì)應(yīng)部分的中心，如圖二所示，并貼好標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明菌種的名稱(chēng)。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28℃溫箱中培養(yǎng)兩天。

　�。�5）觀(guān)察：取出平板，觀(guān)察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點(diǎn)，說(shuō)明脂肪水解，為陽(yáng)性反應(yīng)。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3。葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏

　　小管中注滿(mǎn)培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進(jìn)入空氣，每組五只試管，滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無(wú)菌操作臺(tái)上，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，

　　再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡，第五支不接種，作為對(duì)照。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱(chēng)和所接種的細(xì)菌菌名。

　�。�3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀(guān)察：觀(guān)察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無(wú)氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4。乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小

　　管中注滿(mǎn)培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進(jìn)入空氣，每組五只試管，滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無(wú)菌操作臺(tái)上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，再

　　取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡第五支不接種，作為對(duì)照。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱(chēng)和所接種的細(xì)菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀(guān)察：觀(guān)察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無(wú)氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 5。吲哚試驗(yàn)

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高壓蒸氣

　　鍋內(nèi)滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌操作臺(tái)上將大腸桿菌接入2支蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌接入2

　　支蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。

　�。�3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀(guān)察：往培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入3~4滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試

　　管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽(yáng)性反應(yīng)。觀(guān)察加入試劑后試管內(nèi)的顏色反應(yīng)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6。甲基紅試驗(yàn)

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高

　　壓蒸氣鍋內(nèi)滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌操作臺(tái)上將大腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌

　　接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀(guān)察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入2滴甲基紅試劑，培養(yǎng)基變?yōu)榧t

　　色者為陽(yáng)性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀(guān)察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

　　淀粉水解試驗(yàn)：

　　油脂水解試驗(yàn)：

　　葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：

　　乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：

　　表4。 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽(yáng)性，“—”表示陰性）

　　吲哚試驗(yàn)：

　　甲基紅試驗(yàn)：

　　淀粉分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 油脂分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果