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微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用詳細(xì)介紹
微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位(基因)進(jìn)行的催化反應(yīng)。以下是小編整理的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用詳細(xì)介紹，希望對大家有所幫助。
1.概述
在過去的30多年中，微生物轉(zhuǎn)化或酶轉(zhuǎn)化技術(shù)在有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域中的嘗試不僅使理論研究獲得廣泛開展，在實(shí)際應(yīng)用方面也取得了長足的進(jìn)步。許多化學(xué)合成工藝相當(dāng)復(fù)雜的藥物、食品添加劑、維生素、化妝品和其它一些精細(xì)化工產(chǎn)品合成過程中的某些重要反應(yīng)，目前已經(jīng)能夠用微生物或酶轉(zhuǎn)化技術(shù)得以替代。
這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物轉(zhuǎn)化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反應(yīng)。由于微生物產(chǎn)生的這些能夠被用于化學(xué)反應(yīng)的大多數(shù)生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時對外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(yīng)，因而微生物轉(zhuǎn)化可以認(rèn)為是有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中的一個特殊的分支。某種特殊的微生物能夠?qū)⒛撤N特定的底物轉(zhuǎn)化成為某種特定的產(chǎn)物，其本質(zhì)是酶的作用。因此，對酶轉(zhuǎn)化無需多作解釋，它與微生物轉(zhuǎn)化的差別僅在于：前者是一個單一的酶催化的化學(xué)反應(yīng)，而后者為了實(shí)現(xiàn)這一酶催化反應(yīng)，需要為微生物提供一個能夠生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來看，這似乎是真正的生物轉(zhuǎn)化。
另外，盡管用于生物轉(zhuǎn)化的酶大多來自于微生物，但也可以是來自于動物和植物的酶。而對于一個具體的生物轉(zhuǎn)化來說，究竟是采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，還是采用酶轉(zhuǎn)化技術(shù)，這要綜合考慮實(shí)現(xiàn)這一過程的諸多因素，如成本、環(huán)境、技術(shù)裝備和質(zhì)量要求等。在研究一個微生物(或酶)轉(zhuǎn)化過程時，需要仔細(xì)地考慮諸多方面的問題如：所用轉(zhuǎn)化底物的選擇、所用微生物對不同底物轉(zhuǎn)化能力的考察、轉(zhuǎn)化路線或轉(zhuǎn)化反應(yīng)的選擇等。其中最主要的是尋找適合于所設(shè)計轉(zhuǎn)化過程的微生物，以及如何來提高這種微生物的轉(zhuǎn)化能力，即提高這種酶活力。再則是發(fā)現(xiàn)一種新的酶或一種新的反應(yīng)以便為設(shè)計一個新的微生物轉(zhuǎn)化過程提供一條線索。為了尋找能夠適合作為生物催化劑的微生物酶，除了有必要對原來已知的一些重要的酶或反應(yīng)進(jìn)行重新評價外，一種更為有效的方法是篩選新的微生物菌株或酶。用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株或酶的篩選的范圍應(yīng)該盡可能地廣，因為至目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3000余種能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶，其中有些酶的催化效果比化學(xué)催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們能夠修飾和降解許許多多有機(jī)化合物)，使我們有可能找到某種微生物或酶來催化某種特定的和所期望的化學(xué)反應(yīng)。
2.生物轉(zhuǎn)化與藥物開發(fā)的應(yīng)用
愈來愈多的研究表明，作為治療用藥物的外消旋體混合物有著不可避免的缺點(diǎn)，而美國FDA公布的手性藥物指導(dǎo)原則無疑加快了從頭開始開發(fā)單一異構(gòu)體藥物或利用外消旋體轉(zhuǎn)換技術(shù)從已有的藥物中開發(fā)單一異構(gòu)體藥物的步伐。手性藥物制備的關(guān)鍵技術(shù)是不對稱合成技術(shù)。多年來，有機(jī)化學(xué)工作者已經(jīng)研究開發(fā)了許多種用化學(xué)的方法進(jìn)行不對稱合成的技術(shù)，但近20多年來，很多長期從事化學(xué)合成研究的工作者對微生物和酶反應(yīng)發(fā)生了興趣，與此同時，很多長期從事微生物和酶的研究的工作者對如何將此應(yīng)用于有機(jī)合成發(fā)生了興趣，從而使生物催化轉(zhuǎn)化成為一種進(jìn)行不對稱合成的重要技術(shù)。
應(yīng)用生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行不對稱合成與化學(xué)合成法相比較具有的優(yōu)越性有：
1)轉(zhuǎn)化底物某一基團(tuán)的專一性強(qiáng)，即對不需要轉(zhuǎn)化的基團(tuán)無需保護(hù)；
2)通過對用于某一轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行菌種選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉(zhuǎn)化率；
3)生物催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件溫和且對環(huán)境的污染很小。特別是近年來DNA重組技術(shù)的應(yīng)用和新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)應(yīng)用，使愈來愈多的原來使用化學(xué)方法進(jìn)行不對稱合成的化合物有可能被生物催化轉(zhuǎn)化的方法來替代。
利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行手性藥物的開發(fā)主要進(jìn)行兩個方面的工作：一是進(jìn)行藥物關(guān)鍵中間體的制備，因為利用生物催化轉(zhuǎn)化方法制備對映體純化合物具有很大的吸引力，但試圖利用這種方法來完成所期望的復(fù)雜的有機(jī)合成往往是困難的，甚至是不可能的，而利用這種方法獲得某一關(guān)鍵中間體是切實(shí)可行的；另外，盡管用化學(xué)的方法能夠在實(shí)驗室條件下獲得所需要的手性藥物，但往往是由于成本和技術(shù)問題難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此用化學(xué)生物化學(xué)的制備路線具有獨(dú)特的優(yōu)越性，即所謂的“綠色合成工藝”；二是進(jìn)行消旋化合物的生物拆分或轉(zhuǎn)化，得到單一構(gòu)型的藥物分子。
3.組合生物催化與新藥發(fā)現(xiàn)組合
生物轉(zhuǎn)化(催化)，是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進(jìn)行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段。從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡單和有效。這是一個新的研究領(lǐng)域。天然產(chǎn)物的多樣性和其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，是存在于生物體內(nèi)大量酶的作用結(jié)果。生物體內(nèi)負(fù)責(zé)一系列重要生命活動的酶，在體外同樣具有相同的催化能力。因此，只要體外的催化環(huán)境與體內(nèi)相仿，則能夠?qū)崿F(xiàn)一系列復(fù)雜的，特別是用傳統(tǒng)化學(xué)合成方法難以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)。利用生物催化劑或化學(xué)合成酶催化相結(jié)合的方法，能夠大大地增加衍生物的多樣性，以及能夠有效地對復(fù)雜天然產(chǎn)物的結(jié)果修飾和從簡單的分子構(gòu)建新的化合物庫，在這過程中，往往能夠發(fā)現(xiàn)新的生理活性物質(zhì)。生物催化劑為擴(kuò)大組合化學(xué)提供了各種合成的可能性。
利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性在于：
1)可能進(jìn)行反應(yīng)的范圍廣；
2)能夠定向進(jìn)行區(qū)域選擇性和立體選擇性；
3)不需基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)，一步實(shí)現(xiàn)所需的反應(yīng)；
4)在溫和和均一的條件下可容易地實(shí)現(xiàn)自動化和一步反應(yīng)的重現(xiàn)性；
5)溫和的反應(yīng)條件保證了復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；
6)高的催化活性可以降低催化劑的用量；
7)酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用；
8)生物催化劑可在環(huán)境中完全被降解。
4.近年來一些相關(guān)課題的進(jìn)展
4.1甾體類微生物轉(zhuǎn)化的研究甾體藥物包括激素類藥物和非激素類藥物：前者如性激素、類皮質(zhì)激素和蛋白同化激素等；后者有抗細(xì)菌和抗腫瘤藥物等。由于其不可取代的用途及治療適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，甾體藥物越來越引起人們的重視。利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行甾體藥物生產(chǎn)主要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關(guān)鍵中間體ADD和4AD，以及進(jìn)行立體選擇性的羥化反應(yīng)。
(1)利用微生物轉(zhuǎn)化切除邊鏈，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD微生物對甾體邊鏈的裂解轉(zhuǎn)化是一個很慢的過程，因為底物和產(chǎn)物的溶解性都很差，且底物傳遞至細(xì)胞的過程和產(chǎn)物傳出細(xì)胞的過程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物轉(zhuǎn)化率的重要步驟。我國在微生物轉(zhuǎn)化菌株的菌種選育、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究方面進(jìn)行了數(shù)年的研究工作，最終已經(jīng)獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價值的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，即以天然維生素E生產(chǎn)下腳料(含有混合植物甾醇)為底物制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD的工業(yè)化路線。
(2)利用微生物轉(zhuǎn)化選擇性羥基化，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關(guān)鍵中間體11OH坎利酮我們分別進(jìn)行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選、選育，以及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化等大量研究工作，最終獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價值的微生物轉(zhuǎn)化制備工藝。
(3)利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得多種4AD結(jié)構(gòu)類似物很多甾體藥物的關(guān)鍵中間體與4AD的結(jié)構(gòu)類似物有關(guān)，我們篩選了多種具有不同特性的微生物菌株對4AD進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果得到了一系列的4AD結(jié)構(gòu)類似物。
(4)利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，從植物混合甾醇直接生產(chǎn)睪酮在我們多年對植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化邊鏈切除的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一個非常有意義的現(xiàn)象：即在經(jīng)過誘變處理的大量微生物轉(zhuǎn)化菌種中，發(fā)現(xiàn)了一株能夠直接將植物甾醇轉(zhuǎn)化成睪酮的菌株。同時，轉(zhuǎn)化條件的改變能夠使睪酮的轉(zhuǎn)化率大大地提高。進(jìn)一步的研究表明，能夠?qū)⒅参镧薮贾苯愚D(zhuǎn)化成大量睪酮的微生物菌株，其17羰基還原酶的活性比較高，因而將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的ADD和4AD中17位的羰基還原成為羥基，分別獲得睪酮和去氫睪酮，以及另外一個17位邊鏈發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)類似物。經(jīng)過大量的菌種選育工作和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化工作，已經(jīng)獲得了一條利用微生物轉(zhuǎn)化直接從混合植物甾醇制備睪酮的工業(yè)化工藝路線。
4.2降糖藥物米格列醇的研究開發(fā)米格列醇(miglitol)的發(fā)現(xiàn)源于對微生物發(fā)酵產(chǎn)物野尻霉素的研究，研究顯示該原來作為抗沙門氏菌的抗生素具有較強(qiáng)的α葡萄糖苷酶抑制作用，繼而成為第一個具有開發(fā)價值的淀粉酶抑制劑。1脫氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素還原而得，也可由多種鏈霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生，同樣具有糖苷酶抑制作用。N取代1脫氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑制假單糖α葡糖苷酶，減少單糖的代謝，降低在小腸的吸收。根據(jù)文獻(xiàn)報道，有多種制備米格列醇的化學(xué)合成工藝。其中有以6脫氧6氨基山梨醇為原料，經(jīng)雷尼鎳催化還原后，再與環(huán)氧乙烷反應(yīng)而成。也可以先與環(huán)氧乙烷反應(yīng)后，再在鈀碳催化下還原制得。另外，也有多種利用生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)合成相結(jié)合的方法，以及先用微生物發(fā)酵制備野尻霉素或1脫氧野尻霉素后再用化學(xué)合成的方法來制備米格列醇。本中心研究開發(fā)的米格列醇制備工藝采用生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)合成相結(jié)合的方法，簡要工藝流程如圖7所示。本制備工藝的關(guān)鍵是篩選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)化工藝。
4.3降糖藥物伏格列波糖的研究開發(fā)伏格列波糖是新一代的α葡糖苷酶抑制劑，最初是從某種放線菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的氨基糖類似物，口服后能競爭拮抗性地抑制腸道內(nèi)雙糖類水解酶(α葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐后血糖的迅速上升從而抑制餐后高血糖。同時伏格列波糖明顯降低身體的脂肪量，肥胖的減輕使胰島素受體敏感性增加，進(jìn)而使空腹血糖逐漸明顯下降。據(jù)文獻(xiàn)報道，伏格列波糖的制備除了通過全化學(xué)合成獲得外，還有以下幾條路線：一條路線是由有效霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離出大組分有效霉素A，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后得到關(guān)鍵中間體valienamine和validamine，再經(jīng)過化學(xué)合成即可得到終產(chǎn)物；或是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分有效霉素G，生物轉(zhuǎn)化得到關(guān)鍵中間體valienamine和valiolamine，兩者經(jīng)適當(dāng)步驟的化學(xué)合成反應(yīng)后即可得到終產(chǎn)物；第二條路線是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valienamine，經(jīng)化學(xué)合成后得到終產(chǎn)物；第三條路線是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valiolone，同樣經(jīng)適當(dāng)化學(xué)合成反應(yīng)后得到終產(chǎn)物；第四條路線是由D葡萄糖經(jīng)一系列的化學(xué)反應(yīng)直接合成得到終產(chǎn)物。
4.4N乙酰神經(jīng)氨酸的研究開發(fā)N乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒藥物扎那米韋的前體，其本身也具有多種重要的應(yīng)用價值。目前有三種不同的生物轉(zhuǎn)化方法制備：途徑Ⅰ是一個相對簡單的醛縮反應(yīng)；途徑Ⅱ涉及到反應(yīng)前體ManNAc的磷酸化；途徑Ⅲ所合成的產(chǎn)物Neu5Ac9P需要進(jìn)一步用另外的酶脫磷酸化。這些合成方法均可在體外進(jìn)行，目前已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的是途徑Ⅰ。
目前易采用途徑Ⅰ的生物轉(zhuǎn)化方法，首先從E.coliC600中成功地擴(kuò)增了N乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(nal)，通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，它與來源于E.coliK12的nal序列完全一致。氨基酸序列比對結(jié)果表明，136和164位的氨基酸也為賴氨酸和酪氨酸，與文獻(xiàn)報道的活性中心位點(diǎn)一致。進(jìn)而，將該基因通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點(diǎn)，嚴(yán)格控制起始密碼子和啟動子間距離的情況下克隆到高表達(dá)載體pYG5上，構(gòu)建成新的質(zhì)粒pLY2，并進(jìn)行其表達(dá)研究。然后對粗酶的制備、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化、分析檢測方法的建立，以及產(chǎn)物的分離純化等進(jìn)行了研究，初步獲得了一條適合工業(yè)化生產(chǎn)N乙酰神經(jīng)氨酸的路線。
微生物的指示作用
(1)著生的緣毛目多時，處理效果良好，出水BOD5和濁度低。(如小口鐘蟲、八鐘蟲、溝鐘蟲、褶鐘蟲、瓶累枝蟲、微盤蓋蟲、獨(dú)縮蟲)這些緣毛目的種類都固定在絮狀物上，并隨窗之而翻動，其中還夾雜一些爬行的棲纖蟲、游仆蟲、尖毛蟲、卑氣管葉蟲等，這說明優(yōu)質(zhì)而成熟的活性污泥。
(2)小口鐘蟲在生活污水和工業(yè)廢水處理很好時往往就是優(yōu)勢菌種。
(3)如果大量鞭毛蟲出現(xiàn)，而著生的緣毛目很少時，表明凈化作用較差。
(4)大量的自由游泳的纖毛蟲出現(xiàn)，指示凈化作用不太好，出水濁度上升。
(5)如出現(xiàn)主要有柄纖毛蟲，如鐘蟲、累枝蟲、蓋蟲、輪蟲、寡毛類時，則水質(zhì)澄清良好，出水清澈透明，酚類去除率在90%以上。
(6)根足蟲的大量出現(xiàn)，往往是污泥中毒的表現(xiàn)。
(7)如在生活污水處理中，累枝蟲的大量出現(xiàn)，則是污泥膨脹、解絮的征兆。
(8)而在印染廢水中，累枝蟲則作為污泥正�；蚋纳频闹甘旧铩�
(9)在石油廢水處理中鐘蟲出現(xiàn)是理想的效果。
(10)過量的輪蟲出現(xiàn)，則是污泥要膨脹的預(yù)兆。
另在一些對原生動物不宜生長的污泥中，主要看菌膠團(tuán)的大小用數(shù)量來判斷處理效果。變形蟲（阿米巴）amoeba顧名思義，變形蟲是能變形的。不過這種變形也是有限度的。
一些種類的變形蟲能向四外伸出假足，以探查水中的化學(xué)成分，決定移動方向。而有些種類根本沒有假足。
他們獵食時覆蓋它的獵物，把獵物裹起來，這樣就產(chǎn)生了一個食物泡，食物泡可以消化吸收獵物。
大多數(shù)變形蟲對人體無害,但有幾種變形蟲能產(chǎn)生人類疾病：阿米巴痢疾，主要發(fā)生在貧窮國家。
微生物的定義
什么是微生物呢？所謂微生物是指個體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。（體型微小，必須借助于光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到它們的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)簡單，有的具有細(xì)胞構(gòu)造，有的甚至沒有細(xì)胞構(gòu)造，生長繁殖快，對物質(zhì)具有非常強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)化作用；容易引起變異，以致微生物的種類特別繁多，并且新的種類還在不斷產(chǎn)生；數(shù)量多，分布廣，對自然環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，以致在自然界的任何地方如土壤、空氣、水以及人和動植物體上都有微生物生活或生存）
微生物的特點(diǎn)
微生物是結(jié)構(gòu)簡單、繁殖快、分布廣、個體最小的生物。
1、結(jié)構(gòu)簡單：微生物多數(shù)是單細(xì)胞；
2、生長旺，繁殖快（大腸桿菌在它的適宜37-44℃之間，20-30分鐘繁殖一代）
3、分布廣、種類多（10萬多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等。
4、個體小：小于0.1mm。在形態(tài)上，個體微小，肉眼看不見，需用顯微鏡觀察，細(xì)胞大小以微米和納米計量。
5、適應(yīng)性強(qiáng)，易變異。相對于高等生物而言，較容易發(fā)生變異。在所有生物類群中，已知微生物種類的數(shù)量僅次于被子植物和昆蟲。微生物種內(nèi)的遺傳多樣性非常豐富。
6、代謝活性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快。
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