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會(huì)影響藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的因素
在現(xiàn)實(shí)學(xué)習(xí)生活中，是不是經(jīng)常追著老師要知識(shí)點(diǎn)？知識(shí)點(diǎn)也可以通俗的理解為重要的內(nèi)容。那么，都有哪些知識(shí)點(diǎn)呢？以下是小編收集整理的會(huì)影響藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的因素，供大家參考借鑒，希望可以幫助到有需要的朋友。
微生物的生長受很多因素的影響，特別是藥品中污染的微生物尤為如此。藥品微生物檢驗(yàn)是檢測藥品中具有繁殖能力的活細(xì)胞，這些活的微生物在藥品中處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，它的檢出與否受很多因素的影響，主要影響因素有如下幾點(diǎn)：
一、供試品組分
由于供試品本身的特性，可能含有具有抑菌作用的組分成分，如抗生素中藥中的黃蓮、牛黃、冰片等。另外，很多供試品中加入的抑菌劑或防腐劑用于防止供試品中的微生物再污染和再生殖，以及增溶劑、乳化劑、抗氧劑等其他輔料，這些組分在一定濃度下對微生物具有抑制作用，并可能對藥品中污染的微生物造成不同程度的損傷。供試品中污染的微生物在這些物質(zhì)的影響下有可能檢不出，這時(shí)，它們雖然被抑制甚至受到損傷，但并未死亡，在一定條件在塔門還可以穩(wěn)定地存活一段時(shí)間，當(dāng)微生物生存環(huán)境改變時(shí)，如抑菌成分消除或濃度降低時(shí)，這些微生物便可以復(fù)蘇并繁殖，患者使用后同樣可危及人體健康。對于這些藥品，如按常規(guī)方法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，往往顯示假陰性結(jié)果。
除此之外，在藥品微生物檢驗(yàn)中，由于原料來源不同，特別是中藥制劑，或者生產(chǎn)工藝的差別，使用的輔料不同等原因，使不同廠家生產(chǎn)的同一產(chǎn)品，甚至是同一廠家生產(chǎn)的同一產(chǎn)品不同批次的藥品往往對同一中微生物的生長也有不同程度的影響。
從理論上講，許多藥品含有影響微生物生長的物質(zhì)，許多試驗(yàn)也表明了這一點(diǎn)，表12-1列出了已知試驗(yàn)菌的菌數(shù)在不同藥品中的回收率，有的藥品幾乎對所有試驗(yàn)菌均有很強(qiáng)的抑制或殺死作用。因此，供試品的組分及其濃度直接影響供試品中污染微生物的檢查結(jié)果準(zhǔn)確與否。
二、藥品微生物的檢查方法
檢查方法包括供試液制備方法和微生物檢測方法，它是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的最重要前提。
微生物檢測時(shí)，首先進(jìn)行供試液的制備，不同特性的供試品，應(yīng)采用不同的供試液制備方法，如水溶性供試品直接加稀釋劑制備即可；不溶水的固體供試品采用勻漿或加混懸劑制成均勻的混懸液；非水溶性油劑或軟膏劑，因其與水難溶，使其中污染的微生物難與培養(yǎng)基接觸或因缺氧而無法生長，需采用乳化劑使成均勻分散的乳濁液；有抑菌成分的供試品客加入消除抑菌成分的中和劑；離心沉淀及薄膜過濾消除抑菌成分的方法等，這些物理或化學(xué)的供試液制備方法在進(jìn)行過程或多或少影響著供試品中微生物的回收。
同一份供試液采用不同的微生物檢測方法，如常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法、MPN法等，其檢測的結(jié)果可不同，因?yàn)槠渲兴墓┰嚻窛舛炔煌�，特別是有抑菌作用的供試品。
藥品微生物控制的發(fā)展的研究
微生物污染是藥品質(zhì)量評估的重要指標(biāo)，目前各國藥典收錄的藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法只對藥品終產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，且對無菌檢查不合格的藥品要求不得進(jìn)行復(fù)驗(yàn)。藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室如缺少對實(shí)驗(yàn)環(huán)境的監(jiān)督和控制，則無法評估微生物陽性結(jié)果的污染來源。而藥品檢測過程中的微生物陽性結(jié)果可能源于實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)境的污染，因此判斷檢出菌與環(huán)境菌的相關(guān)性，是排除實(shí)驗(yàn)過程污染、減少假陽性結(jié)果、提高檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必不可少的環(huán)節(jié)。同時(shí)現(xiàn)階段藥品安全管理仍存在監(jiān)管漏洞，當(dāng)藥品受到致病微生物污染時(shí)，往往出現(xiàn)定溯源難、應(yīng)變慢等問題。若建立微生物檢測實(shí)驗(yàn)室日常的環(huán)境微生物菌庫，則可較好地解決上述問題。目前國外通過分子生物學(xué)手段對病原微生物建庫的研究較多，如RIDOMwebsite提供根據(jù)16SDNA序列的差異建立的病原微生物庫。國內(nèi)對制藥環(huán)境建立環(huán)境微生物菌庫相關(guān)方面的研究也有報(bào)道，如PEI等曾采用FTIR法構(gòu)建潔凈室環(huán)境菌的FTIR譜庫，但該方法對微生物的培養(yǎng)條件及預(yù)處理要求嚴(yán)格，隨機(jī)誤差也較大。目前在藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室建立環(huán)境微生物菌庫方面的研究仍較少。
本研究從筆者工作的藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中不同部位、設(shè)備材料及活動(dòng)人員進(jìn)行連續(xù)7個(gè)月采樣收集微生物，共獲得248株細(xì)菌和6株霉菌，對收集的細(xì)菌采用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀(Vitek2Compact)進(jìn)行鑒定，對生化鑒定無確切結(jié)果的90株細(xì)菌及6株霉菌均采用3500MicroSeq基因測序分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA和霉菌LSUrDNA測序鑒定，并對某次采樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌米用Diversilab進(jìn)行同源性分析。通過對鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室環(huán)境微生物庫，為今后本實(shí)驗(yàn)室微生物檢測結(jié)果污染溯源調(diào)查提供了信息保障，同時(shí)也為制藥企業(yè)開展建立環(huán)境微生物信息庫和微生物污染溯源提供了技術(shù)指導(dǎo)。
1材料與方法
1.1儀器與試劑
光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）；VITEK2Compact全自動(dòng)微生物生化儀、全自動(dòng)革蘭氏染色儀、Diversilab同源性分析系統(tǒng)(法國梅里埃)；梯度96孔VertiPCR儀(美國ABI公司）；PowerpacBasic電泳儀(美國Bio-Rad公司）；3500MicroSeq全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統(tǒng)(美國ABI公司)。
1.2環(huán)境微生物的收集
連續(xù)7個(gè)月對微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中不同部位、活動(dòng)人員及設(shè)備材料采用胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環(huán)凱)平板，分別通過接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌采樣器(環(huán)境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環(huán)境沉降微生物取樣)及棉簽擦拭法(設(shè)備和材料表面取樣)進(jìn)行微生物樣本采集，分離純化后共獲得248株細(xì)菌和6株霉菌，采用甘油凍存管置-70°C冰箱保存。
1.3生化鑒定
采用VITEK2Compact對獲得的248株細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物根據(jù)革蘭染色鏡檢結(jié)果選取GN、GP、BCL不同鑒定試劑卡進(jìn)行生化鑒定。
1.4細(xì)菌16SrDNA及霉菌LSUrDNA測序鑒定對VITEK鑒定無確切鑒定結(jié)果的90株細(xì)菌及6株霉菌分別采用3500MicroSeq全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA和霉菌LSUrDNA測序鑒定。采用3500MicroSeq系統(tǒng)配套試劑對90株細(xì)菌和6株霉菌的TSA平板培養(yǎng)物分別進(jìn)行DNA抽提、PCR擴(kuò)増和純化、標(biāo)記反應(yīng)及標(biāo)記反應(yīng)純化，最后進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序。
1.56株金黃色葡萄球菌的Diversilab同源性分析某次采樣收集到6株菌，采用VITEK生化鑒定和16SrDNA測序鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，且在所測16SrDNA基因片段中序列完全相同。為進(jìn)一步獲得6株菌的分型信息，采用基于重復(fù)序列擴(kuò)増技術(shù)的Diversilab同源性分析系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對6株菌分別米用DiversiLab儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR擴(kuò)増?jiān)噭┖邢冗M(jìn)行擴(kuò)増，后吸取1^LPCR產(chǎn)物加入芯片的標(biāo)本孔，進(jìn)行電泳分離擴(kuò)増的DNA的片段，采用儀器自帶軟件繪制基因分型同源性關(guān)系圖。
2結(jié)果
2.1菌株來源統(tǒng)計(jì)
本次建庫收集到環(huán)境微生物分離菌株共計(jì)254株，包括248株細(xì)菌和6株霉菌，所有的霉菌均來源于沉降菌收集。大部分菌株均來源于在微生物實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)的人員(137株)，占全部分離菌株的53.9%。其余環(huán)境沉降微生物(30株)、環(huán)境浮游微生物(47株)及來源于設(shè)備和材料表面的微生物(40株）占全部分離菌株比例相差不大，分別為11.8%，18.5%和15.7%。
2.2環(huán)境微生物菌庫的建立
結(jié)合生化鑒定和測序鑒定結(jié)果的254株微生物的鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)。其中葡萄球菌屬細(xì)菌最多，占全部分離菌的34.3%；其次為芽孢桿菌和微球菌，分別占全部分離菌的32.7%和12.6%。環(huán)境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77株微生物，占污染微生物總數(shù)的30.3%。
葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見環(huán)境菌。從設(shè)備材料和操作人員共收集分離表面微生物177株，占污染微生物總數(shù)的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、菌，分別占表面微生物總數(shù)的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鑒定和測序鑒定2種方法對微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中收集到的254株菌進(jìn)行鑒定，通過鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室環(huán)境微生物庫。
2.3 6株金黃色葡萄球菌的同源性分析結(jié)果
6株金黃色葡萄球菌米用Diversilab系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6株金黃色葡萄球菌高度同源，最低菌株間的親緣關(guān)系也達(dá)到99%(親緣關(guān)系>95%，即為同源)，所以6株菌應(yīng)該來自同一個(gè)污染源。
3討論
從建立的環(huán)境微生物庫各方面的對比情況分析可知，大部分微生物均來源于微生物實(shí)驗(yàn)室中活動(dòng)的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細(xì)菌為人體易攜帶污染的微生物，這兩類微生物在多個(gè)采樣點(diǎn)均有發(fā)現(xiàn)，所以可能是由于人員活動(dòng)或表面接觸帶來的交叉污染，表明操作人員攜帶的微生物是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌的主要來源之一，為了減少污染應(yīng)嚴(yán)格控制人員的更衣和清潔程序。環(huán)境中同樣存在著多種芽孢桿菌，在環(huán)境中不易被消毒滅菌，可能是由于消毒頻次和消毒劑效力問題導(dǎo)致的殘留污染，應(yīng)該増加消毒滅菌頻率并有計(jì)劃地更換消毒劑確保杜絕污染。
本研究通過7個(gè)月的持續(xù)采樣收集環(huán)境微生物，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境微生物庫，但是環(huán)境微生物庫的建立是個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)的過程，因此需要在日常監(jiān)測中不斷完善。本次建庫采用微生物鑒定(生化鑒定和測序鑒定)和分型技術(shù)(Diversilab同源性分析系統(tǒng))對微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行監(jiān)控，建立和健全了日常監(jiān)督檢查方法，為今后開展污染水平的風(fēng)險(xiǎn)評估和不良事件調(diào)查提供技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)也為高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)企業(yè)建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫提供技術(shù)指導(dǎo)。
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